20 - M Zorrilla Zubilete - Junio 2003

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ACERCA DEL USO DE LA TECNICA DE ADN MICROARRAY EN LA INVESTIGACION EN NEUROCIENCIAS

20 - M Zorrilla Zubilete - Junio

ACERCA DEL USO DE LA TECNICA DE ADN MICROARRAY EN LA INVESTIGACION EN NEUROCIENCIAS Lic. María Zorrilla Zubilete (*) (*) Lic. María Zorrilla Zubilete. Lic. en Ciencias Biológicas. Becaria de Perfeccionamiento del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Jefa de Trabajos Prácticos, 1 a Cátedra de Farmacología, Facultad de Medicina, UBA. Resumen Desde hace varios años, la tecnología del ADN recombinante se maneja de manera sencilla. Sin embargo, los datos que se obtienen son los que expresan sólo una secuencia de ADN. En la actualidad existe una técnica que permite el análisis simultáneo de más de 400 fragmentos de ADN. Además de requerir una gran tecnología aplicada, es también imprescindible un análisis riguroso de los datos obtenidos, dado que, hay que discernir y determinar cuáles de los datos son falsos positivos. Esta técnica se llama ADN microarray y permite analizar la expresión de 100 a 2.000 genes de manera simultánea en un pequeño vidrio de 1-2 cm 2 para una misma muestra de ADN o ARN. Esta técnica permite: el estudio de la alteración en la expresión de varios genes simultaneamente, lo que facilita un análisis menos reduccionista de las respuestas alteradas a nivel intracelular generadas por los estímulos ambientales y su expresión conductual. Asimismo permite analizar el efecto de una droga a nivel poblacional evaluando los polimorfismos (variantes) presentes en los blancos farmacológicos. Palabras claves ADN microarray - Expresión de genes - Neuropsicofarmacología Introducción Desde hace 25 años las técnicas para detectar secuencias específicas de ADN o ARN, dependían del uso de una sonda marcada con isótopos radioactivos o fluorescentes, definiéndose como sonda a la secuencia complementaria al fragmento de ADN o ARN que se desea detectar. El experimento consiste en incubar la muestra y la sonda marcada. Si ocurre la hibridización, es decir si se aparea la secuencia de bases de la sonda con algún sector complementario de la muestra de acuerdo al apareamiento de bases determinado por Watson y Crick, se detecta el fragmento específico de ADN o ARN en dicha muestra generando una marca radioactiva o de color fluorescente de acuerdo al tipo de marca utilizada. Los avances tecnológicos han hecho posible minimizar tanto el método simple de una sonda marcada que, en un solo experimento, por medio del ADN microarray se pueden detectar hasta 200 diferentes secuencias específicas de ADN o ARN simultáneamente en un pequeño vidrio o soporte de sílica. El término de ADN microarray actualmente conlleva una variedad de tecnologías que comparten características comunes. En general la técnica está basada sobre el principio del trabajo sobre la secuencia complementaria de ADN (ADNc) que puede ser usada como sonda sobre moléculas de ADN inmovilizado. Esta aproximación se ha desarrollado durante años en los casos de northern o southern blots. En el caso de ADN microarray, la muestra marcada de ADN o ARN en solución es hibridizada (puesta en contacto) con un gran número de moléculas de ADN inmovilizadas y con una localización específica sobre una superficie sólida. Cuando se pone en contacto (hibridización) con todas las secuencias de este array, puede realizarse un análisis simultáneo de varios cientos de genes. Los fragmentos unidos representan la expresión de secuencias de genes obtenidos de varias fuentes. Esto abre la posibilidad finalmente de determinar el estado de expresión de gran parte del genoma de un organismo en un solo experimento. En la actualidad, existen dos tipos de microarrays: el primero es el realizado sobre el soporte de vidrio (Figura 1) y el segundo, de 15 a 30 pares de bases son sintetizados sobre la sílica directamente por un proceso llamado fotolitografía (Figura 2). Entre los posibles campos de utilización del ADN microarray se encuentran: 1) Perfil de expresión de genes: el ARN extraído de una muestra compleja (tales como tejidos o fluidos corporales) es sometido a un análisis de ADN microarray. Los resultados revelan los niveles de expresión de 100 a 200 genes simultáneamente. El resultado es conocido como perfil de expresión de genes. 2) Genotipificación: El ADN genómico extraído de muestras individuales de sangre o saliva es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR o polymerase chain reaction) y luego es aplicado a microarray. El genotipo de 100 o 200 marcadores genéticos pueden determinarse por una simple hibridización. Esta aproximación tiene un considerable potencial en la valoración de riesgos, tanto en investigación como en la práctica clínica. 3) Secuenciación del ADN: El fragmento de ADN es extraído de una muestra de sangre del individuo y aplicado a un resecuenciamiento por microarray. Doscientos pares de bases del ADN pueden ser testeados en un simple microarray para detectar mutaciones en genes específicos, de los cuales la secuencia normal ya es conocida. Esto incrementa la valoración y precisión del diagnóstico molecular tanto en enfermedades genéticas simples como en enfermedades genéticas complejas. Perfiles de expresión de genes en la práctica clínica La capacidad de medir la expresión de 200 genes en cualquier muestra de tejido lleva a una exploración de la función génica a una escala pensada anteriormente como imposible. A través de un análisis global de la expresión de genes, la función de genes previamente identificados por su secuencia de ADN es ahora un tema de rutina. La identificación de nuevas rutas metabólicas y nuevos mecanismos patogénicos, nuevos indicadores para pronósticos de enfermedades, hacen que en los próximos años comience a notarse en la práctica clínica las nuevas estrategias de tratamiento dentro de este marco del nuevo conocimiento. PSICOFARMACOLOGIA // 21

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