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Farmacología Cardiovascular 3

Publicación independiente de Farmacología y Fisiopatología cardiovascular aplicada.

de las moléculas. La

de las moléculas. La interacción de las cabezas de miosina con los filamentos de actina se conoce como "ciclo de enlaces cruzados" (cross-bridge cycling). Al desplazarse, las proteínas contráctiles, tironean juntas de los dos bordes terminales de la unidad contráctil llamada sarcómero. A la microscopía electrónica, el sarcómero está limitado en cada lado por las líneas Z, a las cuales están unidas los filamentos de actina. Por su parte, los filamentos de miosina se extienden desde el centro del sarcómero en ambas direcciones, pero no llegan a alcanzar realmente las líneas Z. Al moverse hacia el centro del sarcómero, los filamentos de actina acercan a las líneas Z al centro, y por lo tanto el sarcómero se acorta. La energía necesaria para este acortamiento es provista por el ATP, principalmente producido en las mitocondrias (figura 1). Los filamentos finos están compuestos por dos unidades de actina, que se enrollan en un patrón helicoidal, siendo ambos soportados por una molécula más pesada de tropomiosina (Tm) que funciona como esqueleto (figura 1). A intervalos regulares de 38,5 nm a lo largo de esta estructura existe un grupo de tres proteínas regulatorias estrechamente ligadas llamadas complejo troponina. De estas tres, es la TnC la que responde a los iones de Ca 2+ que son liberados en grandes cantidades por el retículo sarcoplásmico para comenzar el ciclo de enlaces cruzados. Cuando los niveles de Ca 2+ citosólico son bajos, la molécula de Tm se encuentra enrollada de tal manera que las cabezas de miosina no pueden interactuar con la actina. Por lo tanto, la mayoría de los puentes se encuentran en posición de bloqueo. A medida que los iones de Ca 2+ llegan progresivamente e interactúan con la TnC, esta (activada) se une estrechamente a la proteína inhibitoria troponina I (TnI), la mueve a una nueva posición sobre el filamento fino y debilita, de esta manera, la interacción entre la troponina T (TnT) y la Tm. Finalmente, la Tm se reposiciona sobre el filamento fino, y de este modo, se anula la mayor parte de su efecto inhibitorio sobre la interacción actina-miosina. La hipótesis actual que explica de modo más simple el ciclo de enlaces cruzados sostiene que en este existen dos estados de adherencia: uno fuerte y uno débil, que se alternan sucesivamente. La llegada de Ca 2+ a las proteínas contráctiles constituye el disparador principal de la serie de eventos conocidos como "acoplamiento excitación-contracción". La interacción entre el ion Ca 2+ y la TnC (y la consiguiente liberación-desinhibición de la TnI) transforma los enlaces cruzados del estado débil al estado fuerte. A medida que aumentan los niveles de [Ca 2+ ] i , el estado fuerte predomina. La unión de ATP a las cabezas de miosina sostiene el estado de adherencia débil, aún en presencia de niveles elevados de [Ca 2+ ] i . Contrariamente, cuando el ATP es hidrolizado a ADP + Pi por estas, el estado de adherencia fuerte predomina otra vez. Al comienzo de la diástole, a medida que los iones de Ca 2+ abandonan la TnC, la Tm asume nuevamente la configuración inhibitoria. (HPLC) con una columna de alta afinidad con TnC, para determinar el binding del simendan a la TnC 6 . Otro de los trabajos pioneros, que exploró el sitio de unión del Levosimendan, a cabo por Pollessello y col. 7 Se realizaron estudios de fluorescencia y resonancia nuclear magnética (RNM) protónica sobre TnC humana recombinante dansilada salvaje y con mutaciones sitio-dirigidas, en presencia y en ausencia de levosimendan. Los estudios de fluorescencia mostraron cambios en el patrón de unión del Ca 2+ a su sitio específico de alta afinidad, compatibles con cambios en su binding inducido por el levosimendan. También se evidenció, a través del uso de las variantes mutadas, que probablemente el residuo Asp88 (cercano al bolsillo hidrofóbico del dominio N-terminal de la TnC) desempeñan un papel importante en el efecto que tiene el levosimendan sobre el binding del Ca ++ a la TnC. En concordancia con los resultados descriptos, los Figura 1 Proteínas contráctiles. Tomado de Opie L H. (5) Figura 2 Estructura química del levosimendan. Binding de Levosimendan a la TnC El Levosimendan es el enantiómero levógiro del simendan racémico (figura 2). Es moderadamente lipofílico y tiene un peso molecular de 280.3. Es un ácido débil con un pKa de 6,3, por lo tanto se encuentra predominantemente en su forma no-ionizada en el pH ácido del estómago y el intestino. sobre la base de estas características, se absorbe rápida y extensamente. Haikala y col. describieron por primera vez el sitio de acción del Levosimendan: en sus experimentos utilizaron la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Presión 22 | junio 2004 | farmacologíaCardiovascular

LO CLÁSICO Y LO NUEVO EN FARMACOLOGÍA CARDIOVASCULAR. ANÁLISIS DE DROGAS. estudios de RNM pusieron en evidencia que el fármaco se une a un sitio específico de la TnC y generaron un modelo molecular aproximado que muestra que el levosimendan puede unirse al complejo Ca 2+ -TnC saturado, en el bolsillo hidrofóbico del dominio N-terminal; cercano al sitio donde está localizada la hélice B en la conformación apo de la proteína. Esta localización propuesta es consistente con la idea de que el levosimendan induce un cambio estructural de la TnC unida a Ca 2+ de carácter estabilizante. En un trabajo contemporáneo al de Pollesello, Haikala y col. 8 reportaron que el tiempo de retención del levosimendan en la columna de alta afinidad con TnC aumentaba en presencia de Ca 2+ y Mg 2+ . También observaron que sólo el levosimendan desplazaba hacia la izquierda la curva de fluorescencia inducida por Ca 2+ de la TnC dansilada. De estos estudios se concluyó que la droga se une a los extremos N y C terminales de la TnC. Sin embargo, la prolongación significativa en los tiempos de retención sólo fue observada en concentraciones de Ca 2+ mayores a 1-3 mM, y no se observó un tiempo máximo de retención hasta valores de Ca 2+ de hasta 30 mM. Trabajos posteriores pusieron en duda los sitios y la afinidad de la droga por la TnC. Kleerekoper y col. 9 utilizaron una técnica de RNM heteronuclea para estudiar el binding de las drogas levosimendan y EMD 57033 a la TnC N-terminal marcada (metilMet), libre o en presencia de TnI. Los resultados obtenidos llevaron a la conclusión de que el levosimendan no se une al dominio regulatorio N-terminal de la TnC ni al complejo TnC-TnI. Asimismo, el sistema de diálisis de equilibrio en fase de solución falló en demostrar el binding directo del levo-simendan a la TnC a varios valores de pH y concentraciones iónicas del medio. Los autores concluyeron que, probablemente el mecanismo de acción inotrópico positivo del levosimendan fuera debido a su acción en la inhibición de la PDE III (ver luego). Por su parte, Sorsa y col. 10 realizaron un experimento similar al de Kleerekoper en el que se estudió la interacción del levosimendan con TnC saturada con Ca 2+ . En este estudio se monitoreó estrechamente la estabilidad del levosimendan durante el experimento. Los autores concluyeron, en primera instancia, que el fármaco se comporta de manera inestable en los medios utilizados para la RNM. Ellos observaron también que el sitio crítico de binding del LS a la TnC está dado por la posición Cys84 y que también el fragmento aislado N terminal de TnC muestra interacción con la droga. Los cambios producidos en el patrón de resonancia indican que el binding del levosimendan con su sitio de unión primario produce un cambio conformacional que envuelve a la mayor parte de la TnC. La conclusión final de este trabajo mostró varios sitios de interacción entre el levosimendan y la forma cargada de Ca 2+ de la TnC cardíaca. Este estudio también sugiere que el sitio primario de binding del LS se encuentra en el dominio regulatorio (porción N terminal de la TnC) y que existirían dos sitios de binding secundario en la porción C terminal de la TnC. De esta manera, el levosimendan podría contribuir a la apertura del dominio regulatorio. A pesar de que aún no podía determinarse el sitio preciso de binding a la porción N-terminal de la TnC, debido a los numerosos cambios en el espectro luego de la unión del LS; parecería claro que la presencia del aminoácido Cys84 es de importancia crítica para el binding de la droga. Un trabajo de Levijoki y col. 11 también aportó evidencia sobre el binding de levosimendan a la TnC. En este experimento se utilizaron 9 moléculas derivadas del levosimendan. Se midió el binding Ca 2+ dependiente de las distintas moléculas a la TnC en una columna de HPLC, y por estudios de RNM. También se utilizaron mutantes de TnC para evaluar el papel de ciertos aminoácidos de la hélice e de la porción regulatoria N terminal de la proteína, en el binding al levosimendan. Los autores observaron que los mismos compuestos que se unen selectivamente a la TnC Ca 2+ -saturada (CS) tienen una unión Ca 2+ - dependiente al complejo TnC. El tiempo de retención del levosimendan en la columna de afinidad se acortó a medida que se aumentaba la cantidad de compuesto inyectada en la columna. Esto es consistente con la hipótesis de que el levosimendan tiene un número de sitios de binding restringidos. No se encontró evidencia de unión covalente. Los autores concluyeron, finalmente que, en base a los resultados obtenidos con la TnC dansilada y los cambios químicos de los residuos de metionina (Met47, Met81 y Met85) terminales en la RNM; el levosimendan y al menos su análogo II se unen en la proximidad de la hélice e del dominio de la región regulatoria N-terminal de TnC. También observaron que estos compuestos pueden estabilizar la conformación TnC (CS), lo cual podría ser el principio racional de sus propiedades calcio-sensibilizantes. Con el objetivo de entender qué sitio de binding a la TnC es más relevante en el mecanismo de acción calcio-sensibilizante de levosimendan, Sorsa y col. 12 utilizaron un modelo de troponina completo obtenido por complejización de TnI(32-79) y TnI(128-180) con TnC (CS). La TnI se unió a la TnC(CS) para formar un complejo 1:1:1. La interacción de levosimendan con este complejo fue seguida por estereoscopía de correlación heteronuclear 1H-(15). Se concluyó que, basado en los cambios químicos, la TnI (32-79) bloqueaba los sitios de interacción de levosimendan en el dominio C terminal, mientras que la TnI (128-180) no competía con levosimendan por el binding en el sitio del dominio N terminal. Finalmente, queda claro que el sitio efectivo de binding de levosimendan a la TnC, y que resulta en su efecto sensbilizador al Ca 2+ , está localizado en la porción regulatoria N terminal. Mecanismo de acción inotrópica positiva del Levosimendan El efecto inotrópico positivo del levosimendan fue descripto inicialmente por Haikala y col. 5,6 en 1995. En su trabajo investigaron el efecto de varios sensibilizadores del Ca 2+ sobre la cinética de enlaces cruzados del complejo actina-miosina en músculo papilar intacto de cobayo. Se evaluó como respuesta la velocidad de desarrollo de tensión isométrica (+dT/dt). Se observó que el LS aceleraba la frecuencia de asociación proporcional de enlaces cruzados y desaceleraba la frecuencia de disociación de éstos. Debido a que el efecto observado era más pronunciado en la fase de asociación que en la de disociación, el levosimendan desplazó la curva concentraciónrespuesta de tensión de contracción hacia la izquierda. Basados en el análisis de la disociación, los autores concluyeron que el levosimendan parecía actuar como sensibilizador cálcico en dosis bajas, mientras que en dosis más altas se pondría en evidencia el efecto inhibitorio sobre la PDE III y, de esta manera, sobre la regulación de la fase temprana de la relajación. Otros sensibilizadores cálcicos como el pimobendan y el EMD 53998 mostraban un importante efecto inhibidor de PDE III en bajas concentraciones, mientras que el efecto sobre los enlaces cruzados se produciría en altas concentraciones. Edes y col. 13 estudiaron también los efectos del levosimendan en la función cardíaca y en la fosforilación y sensibilidad al Ca 2+ de las miofibrillas y el retículo sarcoplásmico del cobayo. Estos autores investigaron en forma integrada los efectos del fármaco sobre el corazón de cobayo y profundizaron en su farmacologíaCardiovascular | junio 2004 | 23

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