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Psicofarmacología 39

Revista Latinoamericana de Psicofarmacología y Neurociencia.

Psicofarmacología 6:39, agosto 2006 Introducción Los receptores nicotínicos de la acetilcolina (nAChR) son proteínas neuronales muy importantes que intervienen en la transmisión nerviosa, y que también median la activación muscular en vertebrados. En los últimos años se ha demostrado fehacientemente que estos receptores juegan un papel importante como moduladores del Sistema Nervioso Central (SNC). Son canales iónicos pentaméricos, compuestos por subunidades homólogas pertenecientes a la gran superfamilia denominada del "cys-loop", la que también incluye subunidades que forman receptores para 5HT 3 , GABA A , y glicina (1). Estas subunidades tienen un dominio N-terminal extracelular donde se encuentra el sitio de unión del agonista, cuatro segmentos transmembranales (M1-M4), y un segmento C-terminal extracelular corto. El poro central del canal está rodeado principalmente por los cinco segmentos M2. Las subunidades neuronales están clasificadas en dos tipos, a (que poseen la parte principal del sitio de unión de la acetilcolina) y b. En el sistema nervioso central de mamíferos hay descriptas seis subunidades a (a2-b7) y tres (b2-b4). Hasta el momento, la mejor descripción general de las estructuras terciarias y cuaternarias de estos receptores son las imágenes de mediana resolución (4Å) obtenidas por Unwin (2), las cuales son modelos basados en técnicas de microscopía electrónica. Se carece de una estructura de alta resolución de la región transmembranal que sea utilizable para realizar modelado molecular por homología. Solo existen las estructuras de dos proteínas de caracol que unen acetilcolina (AChBP), que son homólogas a la región extracelular del nAChR, y han sido resueltas a 2.0-2.1 Å (3, 4). También existen estructuras resueltas por RMN de los segmentos M2 aislados, que son los que rodean al poro (5). Sin embargo, estas estructuras de los M2 carecen de la influencia de los restantes segmentos transmembranales, los que muy probablemente afecten sus conformaciones. Para analizar las interacciones con el canal iónico del nAChR de una variedad de moléculas farmacológicamente importantes, hemos estado utilizando un modelo molecular que ha probado ser útil en este tipo de simulaciones (6, 7, 8). En este trabajo analizamos las interacciones entre antipsicóticos atípicos utilizados en el tratamiento de la esquizofrenia y los canales iónicos de dos tipos de nAChRs que existen naturalmente en el SNC: el homomérico a7 (9) y el a4 (2) b2 (3) (10). Se ha demostrado que estos antipsicóticos pueden actuar como bloqueadores de canal abierto (11, 12, 13). Están incluidos el neuroléptico antipsicótico clorpromazina, y los antipsicóticos atípicos clozapina y olanzapina. Además, hemos incluido en el análisis el antiepiléptico carbamazepina, ya que en ocasiones es coadministrado con las anteriores drogas, y era deseable evaluar la posibilidad de que el mismo pueda influenciar el patrón de bloqueo de los antipsicóticos. La posibilidad de que los nAChRs estén involucrados en la esquizofrenia fue sugerida por la alta incidencia de fumadores en la población esquizofrénica, comparada con la población en general, que es de 90% a 30% respectivamente (14). Los pacientes esquizofrénicos son grandes fumadores, aún cuando se comparan con otros pacientes psiquiátricos. Este alto uso de la nicotina puede estar reflejando un intento de automedicación dirigida a un déficit neuronal endógeno (15). Más específicamente, se ha postulado que el receptor homomérico a7 estaría de alguna manera relacionado con la esquizofrenia (16). Estudios posmortem han demostrado una reducción, en el hipocampo de pacientes esquizofrénicos, del número de sitios (moleculares) que unen la a-bungarotoxina (17), sitios que son equivalentes en el SNC a receptores a7. Además, los pacientes esquizofrénicos muestran una deficiencia en el mecanismo de control a las estimulaciones sensoriales auditivas, caracterizadas por una disminución de la supresión del potencial P50 en respuesta a estímulos repetidos. Este déficit ha sido ligado al cromosoma 15q13-14 en la región del promotor del gen de la subunidad a7. La nicotina corrige transitoriamente este déficit en esquizofrénicos y en sus parientes sanos (18). La clozapina, pero no los antipsicóticos típicos, parecen también mejorar este déficit (19), y se ha sugerido que la modulación del hábito de fumar por el tratamiento con clozapina puede ser, en parte, causado por mecanismos similares (20, 21). Otra conexión entre la esquizofrenia y los nAChR fue demostrada en el hipocampo, donde la clozapina y la olanzapina, pero no los antipsicóticos típicos, fueron capaces de producir un aumento importante de la liberación de ACh (22). Por lo tanto, los antipsicóticos atípicos pueden tener papeles opuestos en el sistema nicotínico: por un lado incrementan la liberación de ACh y por el otro, bloquean los canales iónicos de los nAChRs. Si los beneficios terapéuticos de estos antipsicóticos se deben, en parte, al bloqueo de los canales nicotínicos, entonces sería deseable entender desde el punto de vista de la estructura molecular, el comportamiento farmacológico de estas drogas sobre los nAChRs. La inclusión del receptor a4b2 en el análisis podría indicar algunos de los posibles efectos directos o secundarios que estas drogas podrían tener debido a la interacción con un tipo de receptor involucrado en una amplia variedad de funciones en el SNC, tales como memoria, atención y cognición (23, 24, 25, 26), y enfermedades neurológicas tales como la epilepsia (8) En este contexto, el estudio de esta variante nicotínica es también relevante, ya que los antipsicóticos atípicos tienen también ciertos efectos colaterales beneficiosos, tales como el mejoramiento de la disfunción cognitiva, que pueden relacionarse con este receptor, y que es de cierta manera difícil de explicar a través de su acción sobre el sistema dopaminérgico (27). Materiales y Métodos En este trabajo hemos utilizado nuestros modelos moleculares (6, 8) de los nAChRs a7 y a4b2, y los métodos utilizados en un trabajo previo (8), los que son descriptos más abajo. En la Figura 1 se muestran las estructuras químicas de las moléculas utilizadas en este estudio, carbamazepina, clorpromazina, clozapina y olanzapina. Procedimientos de anclado o ubicación de las moléculas en el canal iónico Básicamente, la búsqueda de los sitios de unión de las drogas estudiadas en el canal fue realizada mediante un método combinado de mecánica molecular y grilla energética (28), empleando el programa Affinity (Accelrys, San Diego). El principal programa de mecánica molecular empleado en Affinity es Discover, con el campo de fuerza CVFF incluyendo un término de desolvatacón (29). Más detalles de los métodos empleados pueden encontrarse en un trabajo previo (8). La región correspondiente al canal del receptor fue definida como la del sitio de unión de las drogas. Con el objetivo de acelerar el procedimiento de anclaje de las drogas, el sistema se dividió en átomos "fijos" y "movibles". Los átomos fijos se definen como aquellos átomos del receptor que no están en la región definida como del sitio de unión de las drogas. Estos átomos se mantienen rígidos durante el curso de la búsqueda automática de sitios de unión de las drogas en EDITORIAL SCIENS // 17

Dra. Georgina E. Barrantes, Dr. Marcelo O. Ortells el canal. En un trabajo previo representamos a estos átomos como una grilla energética. En el presente trabajo estos átomos son representados explícitamente y las interacciones entre los átomos masivos y móviles fueron calculadas utilizando el método de celda multipolo, como es implementado en el programa (Accerlrys, San Diego). Este método es más riguroso y eficiente que la aplicación de cortes, está mejor adaptado para grandes sistemas como son los estudiados en este trabajo. Otra diferencia con los métodos empleados anteriormente es que la lista final de estructuras de drogas ancladas en el canal iónico se refinaron aun más utilizando el protocolo de templado simulado. Esta técnica utiliza una búsqueda aleatoria del espacio de conformaciones empezando a temperaturas altas, donde se permiten grandes cambios en las energías de conformación. A medida que la temperatura del sistema se disminuye, el mismo puede quedar atrapado en una nueva conformación de baja energía. Estimación de afinidades Las afinidades teóricas de los confórmeros de las cuatro drogas estudiadas, tanto para los receptores a7 como los a4b2, se basaron en dos tipos diferentes de estimaciones. El primer tipo de cálculo está basado en diferencias de energías estimadas por mecánica molecular. El segundo cálculo es una función de puntaje basada en una regresión lineal. Aunque el segundo método puede dar valores absolutos más realistas de las constantes de disociación, estamos más interesados en sus valores relativos. Un método más preciso para calcular valores absolutos de afinidades de unión y basado en la mecánica molecular, es la aproximación linear de las energías de interacción (30). Este método es una forma de combinar cálculos de mecánica molecular con datos experimentales para construir una función de puntaje modelo para la evaluación de la energía libre de unión entre proteínas y ligandos. Sin embargo, este método requiere de una serie de entrenamiento de datos de constantes de afinidad, la cual no está disponible. Cálculo basado en mecánica molecular Se calcularon las energías libres de unión de cada confórmero como la diferencia entre la energía minimizada del complejo ligando-receptor, y las energías minimizadas del ligando y el receptor en estado aislado. Estas energías fueron calculadas utilizando una aproximación de mecánica molecular utilizando el programa Discover y campo de fuerza CVFF. Las estimaciones de las constantes de disociación Kd basadas en la energía libre no fueron utilizadas para el análisis final (una discusión de este método y de varias de las deficiencias de este tipo de aproximaciones pueden encontrarse en un trabajo anterior) (8). En cambio, las energías FIGURA 1 Estructuras químicas de las cuatro drogas analizadas. libres fueron utilizadas para ordenar los mejores tres confórmeros de cada droga para cada receptor. Función de puntaje basada en regresión lineal El segundo método (31) es una función de puntaje empírica diseñada para el programa LUDI que se utiliza para el diseño de novo de ligandos, y que predice la energía libre DG. En esta función DG se divide en seis términos: DG bind = DG 0 + DG hb S hb ¦(DR,Da) + DG ion S ion ¦(DR,Da) + DG lipo A lipo + DG rot N rot + DG aro S aro ¦(R) donde DG 0 representa la pérdida general de entropía de rotación y translación del ligando. DG hb es la energía libre de las interacciones por puentes de hidrógeno ideales y S hb ¦(DR,Da) es una función de castigo que da cuenta de grandes desviaciones de los puentes de hidrógeno de la geometría ideal. DG ion y S ion ¦(DR,Da) son funciones similares a aquellas descriptas para los puentes de hidrógeno, pero para interacciones iónicas. DG lipo es la energía libre para interacciones lipofílicas, que es proporcional a A lipo , la superficie de contacto lipofílica entre el receptor y el ligando. DG rot describe la pérdida de energía de unión debida al congelamiento de los enlaces rotables del ligando, siendo N rot el número de uniones rotables. El último término, DG aro da cuenta de las interacciones específicas entre anillos aromáticos; la dependencia angular de las interacciones es ignorada solo se utiliza una distancia de corte para determinar la existencia de interacción: (¦(R)=1 para R < 4.5Å y ¦(R)=0 para R 4.5Å). El programa devuelve un valor de puntaje para cada ligando analizado, que se relaciona con K d en la forma de: puntaje = 100 log K d . El confórmero con mejor puntaje entre los tres mejores según el método de mecánica molecular se utiliza para el análisis final. £ Resultados En la Tabla 1 se resumen los resultados obtenidos. Se incluyen para cada receptor los confórmeros con la afinidad mas alta (de acuerdo a los puntajes obtenidos con Ludi, ver Materiales y Métodos) ordenados por su K d . La Tabla muestra los valores de K d estimados y los puntajes totales y segmentados de Ludi. Para a7, la droga con la afinidad teórica más alta es clozapina (100mM). Olanzapina y carbamazepina tienen valores similares (300mM). Se ubicó segunda a olanzapina debido a que su energía de unión calculada por mecánica molecular era más alta. La droga ubicada en último lugar fue la clorpromazina (400mM). TABLA 1 Puntajes estimados del programa Ludi y sus Kd derivados Los valores calculados para los receptores a7 y a4b2 están ordenados por sus correspondientes Kd. Puntaje: puntaje total de Ludi; Kd: constante de disociación; #HB: número de puentes de hidrógeno; HB: puntaje de puentes de hidrógeno; Rot: puntaje rotacional; Aro: puntaje aromático; Lipo: puntaje de contacto; Contacto: puntaje de contacto. Puntaje Kd #HB HB Rot Aro Lipo Contacto a7 Clozapina 402 1x10 -4 1 51 0 0 301 47 Olanzapina 357 3x10 -4 0 0 0 0 307 47 Carbamazepina 358 3x10 -4 1 44 0 0 264 55 Clorpromazina 337 4x10-4 0 0 -64 0 351 56 a4b2 Clozapina 682 2x10 -7 0 0 0 275 357 57 Olanzapina 523 6x10 -6 0 0 0 220 253 40 Clorpromazina 501 1x10 -5 0 0 -64 220 295 46 Carbamazepina 345 4x10 -4 0 0 0 110 185 45 18 // EDITORIAL SCIENS

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