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17 - LM Zieher, LR Guelman - Diciembre 2002

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Neurobiología del sueño

adrenoceptores ß la

adrenoceptores ß la síntesis de melatonina a partir de serotonina sintetizada por el pinealocito. Esta hormona regula conductas importantes tales como la reproducción estacional en respuesta al fotoperíodo, e influencia el reloj circadiano por efectos de feedback sobre los receptores de melatonina, a través de sistemas de segundos mensajeros que activan la PKC, la cual induce la fosforilación del CREB. También la melatonina proyecta a áreas no hipotalámicas como el cerebro basal anterior y la amígdala. La Prokineticina 2 (PK2) cumple con el criterio de actuar como una molécula de “salida” que transmite el ritmo circadiano desde el SCN a los sistemas fisiológicos y conductuales. La transcripción de la PK2 en el SCN es regulada por los genes centrales del reloj y son “encarrilados” por la luz. Los receptores para PK2 se encuentran ubicados en las principales áreas blanco del SCN y su administración a la noche (cuando los niveles endógenos son bajos) suprime la conducta de “wheel-running” en roedores. El reloj molecular Como sistemas biológicos internos, los relojes circadianos surgen de la expresión y la actividad de genes y sus productos génicos. El reloj circadiano está constituido por las actividades reguladas temporalmente de ese grupo específico de genes. El “reloj” consiste en un grupo de genes que codifican componentes moleculares que alternativamente inducen e inhiben la expresión de un subgrupo específico de dichos genes. La expresión de varios de los genes del reloj conduce, a través del tiempo, como consecuencia de las actividades de las proteínas correspondientes, a la subsiguiente inhibición de la expresión de los mismos genes. Luego del recambio de los componentes inhibitorios (disminución de la síntesis de dichos genes), la transcripción de los genes oscilatorios es renovada. El período de este proceso es de unas 24 hs., dando origen al ritmo circadiano. Antes de 1997, no se habían identificado genes de reloj de mamíferos a nivel molecular. El primero que se identificó fue el gen clock de ratón, seguido por aproximadamente 8 genes que fueron implicados en el reloj de mamíferos. El reloj molecular intracelular del SCN consiste en rulos de retroalimentación transcripcional (síntesis de ARN) y traduccional (síntesis de proteínas) positivos y negativos. Dichos rulos son conservados en todos los organismos, probablemente como resultado de una evolución convergente (Figura 4). El rulo de retroalimentación negativa involucra la regulación di- FIGURA 4 Modificado de Reppert SM and Weaver DR: Molecular analysis of mammalian circadian Rhythms. Annu Rev Physiol 2001; 63: 647-676. 8 // PSICOFARMACOLOGÍA

námica de tres genes “period” (en ratón se denominan mPer 1 , mPer 2 y mPer 3 ) y dos genes “Cryptochrome” (en ratón, mCry 1 y mCry 2 ). La transcripción rítmica de los genes Per y Cry en el correspondiente ARNm es inducida por un dominio “hélice-rulo-hélice-PAS” (conformación tridimensional de ciertos sectores de una proteína que proporcionan un sitio de unión al ADN) que poseen los factores de transcripción CLOCK y BMAL1. Los ARNm de Per y Cry son traslocados al citoplasma para ser traducidos a las proteínas PER y CRY, se fosforilan y forman complejos multiméricos que vuelven al núcleo. Una vez allí, las proteínas CRY actúan como reguladores negativos para inhibir su propia transcripción por interacción directa con CLOCK y/o BMAL1. Es decir que, una vez en el núcleo, afectan negativamente la transcripción de sus propios genes, previamente activada por los heterodímeros CLOCK:BMAL1. A través del tiempo, las proteínas PER y CRY disminuyen, en consecuencia se reduce la regulación negativa sobre CLOCK:BMAL1 y éstos pueden iniciar la transcripción nuevamente. Al mismo tiempo, PER 2 contribuye (es decir que regula positivamente) a la transcripción rítmica de Bmal1, lo cual forma el rulo de retroalimentación positiva. Es decir que ese aumento de la disponibilidad de BMAL1 presumiblemente promueve la heterodimerización CLOCK:BMAL1 (promovida por estimulación fótica) necesaria para reiniciar los ciclos transcripcionales de Per/Cry. El rulo de retroalimentación positiva aumenta, a su vez, la regulación del rulo de retroalimentación negativa, por proveer proteínas CRY que inhiban su propia transcripción, perpetuando el ciclo del reloj. Las interacciones entre los genes del reloj y las proteínas que los codifican son esenciales para la existencia del rulo de retroalimentación transcripción-traducción. El modelo Se entiende por día subjetivo el tiempo en el cual el organismo es normalmente activo y noche subjetiva el período de inactividad en el que normalmente ocurre el sueño. El día subjetivo de los animales nocturnos ocurre durante la noche astronómica. El tiempo circadiano es un período de tiempo dividido en una fase de actividad de 12 hs. y una de reposo también de 12 hs. En animales diurnos como el humano, el tiempo circadiano cero (CT = 0) designa el inicio de la fase de actividad y el CT = 12 el inicio de la fase de reposo (inicio de la noche). El modelo propone que al inicio del día subjetivo (CT = 0), la transcripción de Per y Cry es conducida por la acumulación nocturna de los heterodímeros CLOCK:BMAL1 por efecto de la luz. Las oscilaciones circadianas de los niveles de ARNm de Per y Cry en el SCN exhiben perfiles temporales distintos: el ritmo del ARN del Per 1 es máximo a CT = 4-6, Per 3 a CT = 4-8, Per 2 a CT = 8 y Cry a CT = 10. Al CT = 12 (comienzo de la noche subjetiva), las proteínas PER y CRY se expresan sincrónicamente en sus máximos niveles en el núcleo, donde las proteínas CRY “apagan” su propia transcripción mediada por CLOCK:BMAL1. En ese momento, empiezan a decaer los niveles de ARNm de Cry y Per como consecuencia de la acumulación de sus propios productos proteicos. Al mismo tiempo, PER 2 “traslada” un activador transcripcional hacia el núcleo (o co-activa un complejo transcripcional) para aumentar la transcripción de Bmal1, conduciendo a un pico en los niveles del ARNm de Bmal1 entre CT =15-18; es decir que cuando baja la transcripción de Cry, la transcripción de Bmal1 se hace máxima por retroalimentación positiva por acción de PER 2 . BMAL1 empieza a acumularse como materia prima para nuevos heterodímeros CLOCK:BMAL1 durante el día subjetivo y su nivel es máximo durante la noche subjetiva. Cuando los heterodímeros CLOCK:BMAL1 son “liberados” de la inhibición por feedback por parte de CRY, son nuevamente capaces de promover la transcripción de Per y Cry cuando el organismo comienza un nuevo día subjetivo. Es decir que al final de la noche circadiana, las concentraciones de las proteínas PER y CRY son mínimas, el efecto inhibidor sobre la acción de CLOCK:BMAL1 es nulo, pero las concentraciones de los precursores (monómeros CLOCK y BMAL1) en la cadena de síntesis son máximas. La llegada de la luz pone en marcha la heterodimerización de BMAL1 y CLOCK, con lo que se reinicia la actividad diurna del Master Clock, iniciándose un nuevo ciclo. Es probable que el ritmo del ARNm de Bmal1 conduzca a un ritmo similar de la proteína correspondiente BMAL1, pero con un retardo de 4-6 horas. La renovación de los niveles de BMAL1 al final de la noche, probablemente incremente los heterodímeros CLOCK:BMAL1 al tiempo circadiano apropiado (CT = 0) para inducir la transcripción de Per/Cry, comenzando nuevamente el ciclo. Parece ser que la disponibilidad de BMAL1 es el paso limitante para la formación del heterodímero y es crítico para recomenzar los circuitos al comienzo de un nuevo día circadiano. ¿Cómo controla el heterodímero CLOCK:BMAL1 la transcripción de Pery Cry? El gen Clock codifica para un factor de transcripción que posee un dominio hélice-rulo-hélice-PAS. La proteína CLOCK se hetero-dimeriza con BMAL1 y aumenta la transcripción de genes “blanco” (entre ellos Per y Cry) a través de elementos aumentadores o “enhancers” (E-box) ubicados en el ADN de dichos genes, específicamente en la secuencia CACGTG. Estos “boxes” se encontra-ron, por ejemplo, en los extremos 5’ de los genes Per y Cry y en regiones no codificantes de los genes Per 2 y Per 3 . ¿Cómo regulan negativamente los Criptocromos (Cry) su propia transcripción? Los criptocromos son proteínas que contienen flavina (un transportador de electrones) y no está muy claro cómo las proteínas CRY regulan negativamente la transcripción mediada por CLOCK:BMAL1. Se postula que cada una de las proteínas CRY podría directamente separar al heterodímero del E-box del ADN y dejarlo intacto (como parece que ocurre con sus genes homólogos en la mosca de la fruta) o podría separar los componentes del heterodímero en sus monómeros individuales. La unión de CRY a la flavina parecería ser importante para el inicio de reacciones de óxido-reducción en los factores de transcripción con los que interactúa. También es posible que otras proteínas estén involucradas en el mecanismo inhibitorio. Ha sido demostrado que CRY 2 se heterodimeriza a través de tetratricopéptidos de una serina-treonina fosfatasa, la cual también se une a la proteína de heat shock 90, la cual también tiene la capacidad de interactuar con factores de transcripción que contienen el dominio hélice-rulo-hélice-PAS (incluyendo BMAL1). A pesar de que CRY 1 y CRY 2 cumplen la misma función, es decir, son redundantes, son esenciales componentes de la “pata” negativa del rulo de retroalimentación: si uno de los dos genes sufre una mutación, el otro es suficiente para mantener la ritmicidad, pero la pérdida de ambos genes implica una alteración de la ritmicidad. ¿Cuál es la participación de las proteínas Per? El dominio de dimerización PAS que poseen las proteínas PER sugiere que las interacciones proteína-proteína son importantes. La proteína CRY es necesaria para estabilizar y translocar al núcleo a PER 2 en el proceso de regulación positiva de Bmal1. PSICOFARMACOLOGÍA // 9

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