ACERCA DEL USO DE LA TECNICA DE ADN MICROARRAY EN LA INVESTIGACION EN NEUROCIENCIAS
FIGURA 1 Análisis de la
FIGURA 1 Análisis de la expresión de genes a partir de muestras diferentes utilizando la técnica de ADN microarray. Muestra 1 Muestra 2 Muchas áreas de la investigación biomédica, incluyendo la farmacología han sido objeto de los estudios experimentales de secuenciación de ADN, tanto en humanos como en organismos inferiores. Sin embargo, el conocimiento de la secuencia de un fragmento de ADN como dato es insuficiente para determinar la función y el rol en el metabolismo celular. Sin embargo, el desarrollo de nuevas tecnologías específicamente diseñadas para el estudio del genoma se hallan en constante crecimiento. Uno de las más promisorias aproximaciones en esta área, es la técnica de ADN microarray o también conocida como ADNchip o gen chips. ARNm ADNc TEP 1 Aplicaciones del ADN microarray Actualmente los datos de mayor desarrollo de ADN microarray se ha dado en el campo del cáncer (2, 3) y de las investigaciones genéticas (9, 10). Sin embargo, en otras áreas de la investigación biomédica aún no se ha desarrollado sistemáticamente. Uno de los aspectos claves de este proceso involucra el uso de ADN microarray para la detección y genotipificación de polimorfismos. Por ejemplo para los polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs), que son el cambio de una sola base de la secuencia de ADN que ocurre entre individuos en una población. Es considerable la potencial aplicación del mapeo de SNP en condiciones neurológicas o neuropsiquiátricas, como ya ha sido demostrada para la esquizofrenia (8). El sistema nervioso es especialmente sensible a la tecnología del microarray porque ofrece una gran complejidad en el patrón de expresión de genes y son muchos los genes que se expresan específicamente en el cerebro. Sin embargo, dada la complejidad de este sistema es necesario diseñar un estudio apropiado y un análisis riguroso de los datos obtenidos por esta tecnología (4). TEP 1 ADN microarray Adaptado de Brown P O y Botsein D. "Exploring the new world of the genome with DNA microarrays". Nat Genet 1999,21 (1 Suppl): 33-37. El ARN mensajero es extraído de las muestras, luego es marcado con colorantes rojo o verde (cada muestra se colorea con un color distinto). El ARNm marcado de ambas muestras, se siembra en cada pocillo de la placa que contiene ADNc y se unen de acuerdo a la secuencia complementaria con cada fragmento de ADNc (proceso conocido como hibridización). Cada pocillo representa un gen. Cada ARNm se une en cada pocillo, de acuerdo al nivel de expresión para ese gen presente en las muestras sembradas, generando una marca de color. Luego de la hibridización las señales fluorescentes roja y verde se cuantifican. La proporción de verde y rojo representa la expresión relativa de cada gen en las dos muestras. En la foto se observa que el gen TEP1 se expresa más en la muestra 2 (mayor color rojo) que en la muestra 1 (menos color verde). El rol de los estudios de expresión de genes Luego de varios años, los avances tecnológicos en biología molecular y genética han conducido al estudio de tejidos a nivel de proteínas individuales y sus respectivos genes. La transcripción del ADN genómico en ARNm es el primer paso en el proceso de la síntesis proteica. En consecuencia, las diferencias en la expresión de genes son responsables tanto de las diferencias estructurales como de las fenotípicas en la expresión de las proteínas respectivas. Esto actualmente ha sido reemplazado en el estudio de los mecanismos de comunicación intercelular y las cascadas intercelulares que ellos producen, dado que el ADN microarray está siendo frecuentemente usado como un sustituto de los métodos convencionales de evaluación de los niveles de ARNm. Sin embargo, otro uso de los ADN microarrays es su potencial capacidad para acelerar el descubrimiento de la función de genes desconocidos. Por análisis del perfil de expresión de transcriptos (ARNm) relevantes para enfermedades o para tratamientos, pueden identificarse y abrirse nuevas líneas de investigación. Sin un adecuado entendimiento de la función de los genes individuales y sus respectivas proteínas, la información de la secuenciación (obtenida a partir de la secuenciación del genoma humano) es de poco valor. Por otro lado, hay que tener en cuenta que los análisis utilizados usualmente para comprobar la expresión de un gen, como son las técnicas de northern blot, RT-PCR, hibridización in situ son necesarias e indispensables para complementar los estudios de ADN microarray. 22 // PSICOFARMACOLOGIA
FIGURA 2 Análisis de la expresión de genes usando microarrays de oligonucleótidos. 1.28 cm 20-25 um 20-25 um 1.28 cm (tamaño standard) MAS DE 40.000 RASGOS POR MICROARRAY MILLONES DE OLIGONUCLEOTIDOS POR RASGO Ilustración adaptada de Affymetrix, Santa Clara, CA, USA Millones de oligonucleótidos (con extensión de 15 a 30 pares de bases de ADN) son sintetizados sobre la placa del microarray directamente por fotolitografía y actúan como sonda de "rasgos" individuales. Alrededor de 30 oligonucleótidos diferentes son impresos para cada "rasgo", representando la secuencia parcial de un gen. La lectura de la marca se sistematiza de igual manera que la descripta en la figura 1. Como desventaja de esta técnica se debe mencionar la existencia de un alto número de falsos positivos, lo que obliga la realización de un muy buen diseño experimental y a la repetición de experimentos en diferentes muestras. Aplicaciones de ADN microarray en neuropsicofarmacología La identificación y la expresión de genes en poblaciones específicas de neuronas, ofrece una considerable promesa en la elucidación de los efectos de enfermedades neurodegenerativas como en la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, los estudios de ADN microarray pueden ser sólo útiles para ayudar a dilucidar las bases moleculares de las complejas interacciones neuronales y su salida comportamental. Además de ayudar a evaluar procesos patofisiológicos específicos, las técnicas de ADN microarray pueden servir para examinar los efectos generales de las intervenciones terapéuticas en modelos animales. Por otra parte, uno de los desafíos en el área de la investigación neuropsiquiátrica es el estudio y profundización de las bases neurobiológicas de la esquizofrenia. La naturaleza patofisiológica de este desorden, acoplado con la gran heterogeneidad de los síntomas clínicos y su progresión variable en el tiempo, hace que se constituya como uno de los mayores desafíos actuales para su análisis con esta nueva tecnología (5, 6). El riesgo de morbilidad por esquizofrenia durante el curso de la vida es para la población general de un 0,8%, Este riesgo se incrementa a un 3 a 5% en parientes de segundo grado o mediohermanos, al 9 a 12% en hermanos y gemelos dicigóticos y al 40-50% en gemelos monocigóticos de pacientes esquizofrénicos o en hijos de dos parientes esquizofrénicos. Esta situación sugiere la fuerte base genética que presenta esta enfermedad. La heredabilidad de la esquizofrenia es de alrededor del 80% pero la búsqueda de los genes que portan la susceptibilidad a la enfermedad es dificultosa particularmente por tratarse de una enfermedad de base multigénica. Sin embargo, la búsqueda de causas etiológicas también incluye factores de riesgo ambientales, entre los que se puede citar: la desnutrición materna, las infecciones virales durante períodos críticos del desarrollo fetal, la hipoxia fetal y otras complicaciones obstétricas, el nacimiento en épocas invernales y el uso de drogas psicoactivas. Basados en las técnicas de ADN microarrays, el grupo de Mirnics y colaboradores (7) analizó más de 7.800 genes provenientes de muestras de pacientes control y esquizofrénicos, concluyendo que pocos grupos de genes mostraban diferencias entre esquizofrénicos y los controles. Sin embargo, grandes diferencias se hallaron en las proteínas presinápticas denominadas PSYN. Estas variaciones demuestran que la enfermedad tiene "rúbricas moleculares". Sin embargo, los factores de susceptibilidad genética y las adaptaciones fisiológicas (como los cambios en la expresión de la proteína RGS4. Para mayor detalle ver el artículo de Guelman L R. Psicofarmacología 15, 2002) llevan a la perturbación de la misma función: la señalización entre neuronas. Por análisis de PSICOFARMACOLOGIA // 23
