Sitios de binding y mecanismo de acción inotrópica del
levosimendan
posible efecto sobre la
posible efecto sobre la PDE III. Se utilizaron fibras denudadas (skinned fibers) de músculo papilar, técnica que permite el acceso de las distintas moléculas del medio al citosol de la célula miocárdica, de modo que es posible controlar las concentraciones intracelulares de Ca 2+ y otros electrolitos. Este modelo mostró la habilidad del levosimendan para aumentar, en forma dosis-dependiente, la fuerza de contracción de las fibras miocárdicas a concentraciones fijas de Ca 2+ (1 mM) (figura 3). Se analizó también el binding de 45 Ca 2+ y [ 3 H] levosimendan a la TnC de las miofibrillas solos o combinados. Estos no mostraron diferencia significativa en el grado de binding de Ca 2+ con los miofilamentos, en presencia de 10 mM de levosimendan. Asimismo se midió la recaptación de Ca 2+ por vesículas de retículo sarcoplásmico en presencia o ausencia de levosimendan. Los resultados indicaron que la droga no tenía efectos directos sobre la recaptación. Sobre los mismos preparados se determinó la función del ventrículo izquierdo, medida como contractilidad (+dP/dt), relajación (-dP/dt) y frecuencia cardíaca espontánea. La perfusión de los corazones de cobayo con concentraciones crecientes de levosimendan resultó en un Figura 3 Registros que muestran el efecto de concentraciones crecientes de levosimendan en el desarrollo de fuerza contractil en fibras de músculo cardíaco denudadas. Figura 4 aumento significativo de la +dP/dt, aún a concentraciones de 0,03 mM de droga. En contraste, la velocidad de relajación (-dP/dt) no se modificó a concentraciones de 0,03 y 0,1 mM pero sí a 0,3 mM. En concentraciones bajas, el levosimendan no aumentó la frecuencia cardiaca espontánea, pero sí lo hizo en altas dosis, de manera tiempo-dependiente. Por otra parte, se evaluó la incorporación de 32 P en las proteínas de corazón de cobayo (fosfolambano, TnI, proteína C y las cadenas livianas de miosina). En bajas de levosimendan (0,03 mM), se observó un aumento leve pero significativo de la fosforilación del fosfolambano, pero no de las demás proteínas. La administración de mayores concentraciones (0,1-0,3 mM) fue asociada con significativos aumentos de la fosoforilación de TnI, proteína C y fosfolambano. Experimentos paralelos comparativos con isoproterenol mostraron niveles de fosforilación de las mencionadas proteínas mucho más altos. También se estudió el contenido de AMPc en corazones tratados de la misma manera que los anteriores. No se observaron cambios en los niveles de AMPc en bajas concentraciones de levosimendan (0,03 mM); sin embargo, en concentraciones más altas (0,1-0,3 mM), se observó un aumento significativo de los niveles de AMPc. Los niveles de GMPc no se modificaron en ningún caso. Los autores de este La figura resume la dependencia de la fuerza de contracción en preparados de fibra denudada a concentraciones crecientes de levosimendan. Las mediciones fueron hechas a concentraciones fijas de Ca 2+ en el medio: pCa 6,0, a 22° y 37°. Cada valor representa la media ± ds de seis preparaciones de diferentes corazones expresado como el porcentaje de la mayor fuerza obtenida a pCa 4,5. *p
LO CLÁSICO Y LO NUEVO EN FARMACOLOGÍA CARDIOVASCULAR. ANÁLISIS DE DROGAS. trabajo encontraron que los resultados son consistentes con la hipótesis de que el levosimendan se une a la porción N terminal de la TnC, cercano a la región regulatoria del sitio de unión al Ca 2+ y de esta manera, estabiliza la conformación de la proteína unida al Ca 2+ , aumentando así el nivel de filamentos finos activados sin cambios en el binding del ion. En bajas concentraciones de la droga y en condiciones de ausencia de AMPc, se observó el efecto directo del levosimendan sobre la fuerza de contracción, a través de la sensibilización de la TnC al Ca 2+ . Asímismo, en preparaciones de corazón entero se confirmó que, a bajas concentraciones, el fármaco aumentó el inotropismo cardíaco, sin afectar la frecuencia cardiaca espontánea y la relajación. También, los autores concluyeron que, a bajas dosis, la única proteína parcialmente fosforilada fue el fosfolambano. Este último fenómeno podría explicar que levosimendan se comporte primariamente como un sensibilizador cálcico y que el efecto de fosforilación sobre el fosfolambano actúe como contrapeso en el posible deterioro de la fase de relajación. En concentraciones altas, el levosimendan aumentó tanto el inotropismo positivo como la frecuencia cardíaca, el lusiotropismo y la fosforilación de proteínas en corazones intactos; sugiriendo un mecanismo de acción dependiente de la inhibición de PDE III y aumento del AMPc. En un estudio posterior, Boknik y col. 14 estudiaron los efectos sobre la contractilidad ejercidos por el levosimendan en distintos fragmentos de corazón de cobayo. En aurícula derecha aislada con latido espontáneo se observó aumento de la frecuencia de contracción a concentraciones de 0,1 mM, 1 mM y 10 mM y no a concentraciones de 100 mM. Por otra parte, en aurícula izquierda aislada y reserpinizada se observó un aumento de la fuerza de contracción de hasta 250% del valor pre-droga a concentraciones de 0,1 mM, 1 mM y 10 mM. En músculo papilar aislado el EIP alcanzó valores máximos de 130% +/- 8,6% del valor pre-droga en concentración de 10 mM (figura 5). Con el fin de estudiar la participación del AMPc en el EIP ejercido por el levosimendan, se estudió la acción del carbacol en el sistema. Se observó que el agonista colinérgico a concentración de 10 mM disminuía el EIP provocado por 10 mM de levosimendan en un 69,6% ± 6,2%. Por lo tanto, se concluyó que el EIP inducido por levosimendan está mediado, al menos en parte, por aumento del AMPc. También se midieron directamente los niveles de AMPc, observándose un incremento estadísticamente significativo para las concentraciones de levosimendan de 1; 10 y 100 mM con respecto al control. En la última concentración se alcanzaron los niveles máximos de AMPc, pero se observó una disminución del EIP. Sobre la fosforilación de proteínas se observaron los siguientes resultados: la droga produjo una fosforilación significativa del fosfolambano, comenzando a concentraciones de 1 nM y de la TnI a concentración de 10 nM. Los valores máximos se vieron con concentraciones de levosimendan de 1 mM (para fosfolambano, 134% ± 8,6% y para TnI, 124% ± 4,2 % del control). No se observaron fosforilaciones de las cadenas livianas de miosina en valores de 0,1 nM a 10 mM. Por otra parte, a concentración de 100 mM el estado de fosforilación de todas las proteínas estudiadas se redujo considerablemente. Sobre las corrientes de Ca 2+ se observó un incremento notable de la amplitud en los canales tipo L, similares a los producidos por las drogas que aumentan el AMPc, como el isoproterenol. Los autores concluyeron que los resultados sugerían fuertemente que el levosimendan aumenta en forma directa la fuerza de contracción. Algunos hallazgos del estudio concuerdan con la visión de que la droga es un sensibilizador del calcio y un inhibidor de la PDE III, efectos estos que se balancean. Los efectos sobre la fosforilación de proteínas estarían mediados a través de la protein quinasa A (PKA) que explicarían, al menos en parte, los efectos inotrópico y lusitrópico positivos del levosimendan. Haikala y col. 15 también estudiaron el efecto del levosimendan sobre las PKA y PKG (AMPc y GMPc dependientes), con el fin de explicar cuál es el mecanismo más relevante de acción inotrópica positiva de esta droga. En su trabajo de 1997 se utilizaron preparados de corazón aislado, músculo papilar y fibras denudadas. Se evaluaron, EIP, cronotropismo, flujo coronario y sensibilidad al Ca 2+ de las proteínas contráctiles. Las PKA y PKG fueron inhibidas farmacológicamente, de manera de poder diferenciar el aporte a la fuerza de contracción dado por la inhibición de la PDE III vs. el efecto sobre la sensibilización cálcica. En este estudio se encontró que, en presencia del inhibidor selectivo de la PKA, KT5720, el levosimendan era 10-20 veces más potente como inotrópico que el inhibidor de la PDE III, milrinona. Además, este inhibidor no antagonizó los incrementos producidos por el levosimendan en la presión sistólica del ventrículo izquierdo a concentraciones de hasta 0,03 mM. Figura 5 A) Efecto de levosimendan en la fuerza de contracción en músculo papilar derecho aislado y estimulado eléctricamente de cobayos reserpinizados. Ordenadas: fuerza de contracción e % de valores pre-droga (Ctr). Abscisas: concentración de levosimendan en mM. B) Efectos de Isoproterenol sólo () y luego de pre-tratamiento con levosimendan (h) en la fuerza de contracción. Abscisas: concentración de isoproterenos en M, Valores de fuerza de contracción en pre-droga= 1,227 +/- 0,24 nM (n=26). *: diferencia significativa respecto al control. Tomado de Boknik P. (14) farmacologíaCardiovascular | junio 2004 | 25
