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farmacología cardiovascular 58 | septiembre de 2023 Estructura y Mecanismo de Acción de los ASOs/siRNA En líneas generales, las RTDs se valen de la interacción entre cadenas sintéticas de oligonucleótidos y cadenas de ARN celulares, para generar sus acciones. Estas drogas pueden ser divididas en dos grupos según su estructura, por un lado, los oligonucleótidos antisentido (ASOs, Antisense Oligonucleotides), que son cadenas de una sola hebra de oligonucleótidos que se unen a hebras de ARN complementarias a su secuencia, y por otro lado los ARN de interferencia pequeños (siRNA, small interfering RNA), cadena de dos hebras conformada por oligonucleótidos que utilizan la enzima AGO2. Ambos grupos tienen como fin alterar el fenotipo de la enfermedad mediante la degradación selectiva de un ARN diana, llevando a la disminución de la síntesis de proteínas implicadas en ciertas patologías. Partiendo de una proteína que participe en una determinada enfermedad, se busca la secuencia de ARNm que la codifica, luego se sintetiza en el laboratorio una secuencia complementaria (antisentido) a la misma, la cual es administrada e ingresa a las células, donde se une a su ARNm. Este ARN no puede ser traducido hacia una proteína y así se logra interferir en el curso de la enfermedad. Sentido y antisentido hacen referencia a la polaridad de una cadena de nucleótidos. La cadena sentido (codificante o positiva) es aquella que tiene la secuencia de nucleótidos que, al ser leída por los ribosomas, codifica para una proteína. Por otro lado, la cadena antisentido presenta una secuencia de nucleótidos contraria (no codificante o negativa) a la cadena codificante. Por apareamiento de bases, ambas cadenas pueden unirse formando una doble hebra. Tanto los ASOs como los siRNA están formados por cadenas antisentido que de una forma u otra interactúan con las hebras codificantes del material genético de la célula. Otro concepto importante es el de oligonucleótido, el cual hace referencia a una cadena de nucleótidos menor a las 50 bases nitrogenadas de largo. Tanto los oligonucleótidos antisentido como los ARN de interferencia pequeños son, en esencia, oligonucleótidos. En la tabla 1 se describen las características de estas moléculas. Los ASOs se encuentran constituidos por cadenas de nucleótidos simples (de una sola hebra) unidos mediante enlaces fosfodiéster que forman una columna o backbone. La longitud aproximada de estas cadenas es de entre 15 y 20 nucleótidos. Por otro lado, los siRNA están formados por dos cadenas de nucleótidos: una cadena antisentido “guía” y una hebra “pasajera” que actúa como un transportador de la anterior. Tienen una longitud de entre 19 y 22 pares de bases y un peso mayor a los ASOs. La estructura de estos fármacos tiene implicancias importantes no sólo para su mecanismo de acción, sino también para su farmacocinética y efectos adversos. Por ejemplo, las cadenas más largas corren el riesgo de ser detectadas por el sistema inmunológico y disparar respuestas celulares como si de un virus se tratase. La modificación de los grupos fosfato (PO), los azúcares y la conjugación con monosacáridos (ver más adelante) son estrategias muy utilizadas para modificar la farmacodinamia y farmacocinética de estas drogas. Según su estructura, los diferentes fármacos antisentido se clasifican en generaciones. La primera generación se caracteriza por la modificación en los grupos fosfato de la columna. La segunda generación abarca los fármacos que tienen grupos alquilo en sus nucleótidos. La tercera generación se compone de los oligonucleótidos más estables y más efectivos (in vitro), se caracterizan por presentar otras modificaciones químicas que mejoran sus propiedades farmacodinámicas principalmente. Hablando específicamente de los mecanismos de acción que pueden ser utilizados por los RTDs, encontramos dos caminos principales: Degradación mediada por ocupación y mecanismos sólo de ocupación. En la degradación mediada por ocupación, luego de la unión de los RTDs al ARN diana se produce una degradación enzimática del ARN. Este mecanismo es utilizado tanto por los ASOs como por los siRNA. Las principales enzimas implicadas son la Ribonucleasa H1 (principalmente para los ASOs, y Argonaute 2 (principalmente para los siRNA). La enzima RNasa H1 es una endonucleasa (corta los enlaces interiores de la cadena de ácidos nucleicos) que pertenece a la familia de las ribonucleasas H, su función en las células es regular la expresión de distintos ARNm tomando como molde secuencias de ADN. En el caso de los ASOs, el mecanismo de acción implica al siguiente proceso: El ASO ingresa a la célula y se encuentra con la RNasa H1, la enzima reconoce una secuencia de nucleótidos en el ASO y forman un complejo enzima-RTD, que localiza el ARN al cual está dirigida la terapia, la enzima reconoce la secuencia complementaria en el ARN mensajero, el cual es clivado en diferentes sectores por la RNasa H1 y se degrada, y finalmente la proteína codificada por el ARN mensajero no es sintetizada. Argonaute 2 es una endonucleasa que reconoce duplas de ARN-ARN, y que se encuentra implicada en la respuesta celular contra los virus. Es una enzima que permite pocos cambios químicos en las cadenas del siRNA, lo que significa que su estructura tiene menos posibilidades de ser modificada. En el caso de los siRNA, el mecanismo de acción implica el siguiente proceso: El siRNA ingresa al citoplasma y es reconocido por Ago2, que procede a separar las hebras y permitir la degradación de la cadena “pasajera”. Luego, Ago2 forma un complejo llamado RISC con la cadena “guía”, que detecta el ARNm complementario a la cadena “guía” del siRNA. Ago2 procede a hidrolizar la cadena blanco de ARN, y el complejo RISC permanecerá activo por un tiempo prolongado, degradando más cadenas diana. EDITORIAL SCIENS // 5
En los mecanismos solo de ocupación, la unión del RTD al ARN diana impide su traducción sin utilizar enzimas, gracias a lo que se conoce como bloqueo estérico en donde el RTD impide físicamente la acción de los ribosomas. Solamente los ASOs utilizan este mecanismo. El principal resultado del bloqueo estérico consiste en la detención de la traducción o la alteración de estructuras importantes dentro del ARNm que impiden el inicio de la traducción. De esta forma, al no ser traducido el ARNm diana, disminuye la expresión de la proteína que codifican. Un dato importante es que también se pueden diseñar ASOs capaces de aumentar la síntesis de una proteína. Estos ASOs están dirigidos contra los microARN (mi-ARN), pequeñas secuencias de nucleótidos que la célula utiliza para degradar al ARNm y evitar su transcripción. Si se diseña un ASO capaz de bloquear a los mi-ARN, se logrará evitar su efecto represor, aumentando así la cantidad de proteínas que se traducen (up-regulation). Estaríamos “inhibiendo” a un “inhibidor”. Farmacocinética En líneas generales, tanto los siRNA como los ASOs presentan una muy baja biodisponibilidad oral, no penetran la barrera hematoencefálica (BHE), tienen unión a proteínas plasmáticas, utilizan mecanismos de ingreso a las células, se internalizan en endosomas y carecen de metabolismo por citocromos. La administración de estas drogas local se ve determinada por la patología para la cual fue diseñado el fármaco, siendo relevantes para las patologías sistémicas la utilización de las vías endovenosa (EV) y subcutánea (SC). Ambas presentan una buena biodisponibilidad (BD) pero la presencia de nucleasas en la piel puede disminuir levemente el porcentaje de fármaco absorbido en la vía subcutánea. Un inconveniente fundamental en lo que respecta a las RTDs es garantizar las concentraciones necesarias en las células que expresan el ARN diana. Para mejorar este aspecto y permitir la llegada hacia órganos específicos, se utiliza la conjugación con distintas moléculas. Una de las más importantes es la N-acetilgalactosamina cuyo receptor se expresa de forma exclusiva en los hepatocitos. Abreviado como Gal- Nac, este monosacárido se conjuga con los RTDs y permite su interacción con los receptores ASGPR-3 que se encuentran expresados en la superficie de estas células lo que determina su rápida endocitosis. Así, se logra mejorar de gran manera el perfil farmacocinético de estos fármacos. Según estudios, la conjugación con GalNac sería la responsable de una marcada disminución de la cantidad y gravedad de efectos adversos en comparación con RTDs no conjugados por su exposición sistémica. Se ha demostrado que, en drogas que tengan acción a nivel hepático, la conjugación con GalNac aumentaba hasta 30 veces la magnitud de la respuesta observada en los participantes a mismas dosis. Estos hallazgos permitieron elaborar esquemas de tratamiento con dosis considerablemente más bajas, lo que finalmente disminuye la exposición sistémica y por ende los efectos adversos, sin disminuir la efectividad. Los ASOs presentan en su estructura regiones hidrofílicas correspondientes a los grupos PS (fosforotioato) e hidrofóbicas, correspondientes a las bases nitrogenadas. Es por ello que se comportan como moléculas anfipáticas. En lo que respecta a su administración, su estructura permite generar drogas que se administren por casi todas las vías: subcutánea, endovenosa, oral e inhalatoria. De todas formas, la administración oral cuenta con una baja biodisponibilidad y no parece ser una alternativa útil. En ASOs que presenten grupos PS y una longitud mayor a 12 nucleótidos la distribución sigue un patrón similar: presentan unión a proteínas plasmáticas con una distribución amplia, acumulación en tejidos ricos en lípidos (hígado, riñón, tejido adiposo, médula ósea y bazo) y una vida media plasmática de 1-2 horas. La vida tisular ronda las 3-4 semanas y la administración en dosis altas permite saturar los depósitos, alcanzando semividas de hasta 6 meses en los tejidos. La conjugación con GalNac permite el envío preferencial al hepatocito, lugar casi exclusivo de expresión de su receptor, ASGPR-3. Al interactuar con su ligando, el receptor de GalNac permite la endocitosis del ASO. Esta modificación incrementa hasta 30 veces el efecto de la droga en comparación a las mismas Tabla 1 Diferencias entre los dos grandes grupos de RTDs Característica Estructura de cadena Longitud y peso Monómeros utilizados Mecanismo de acción Oligonucleótidos antisentido Cadena simple: antisentido 15-20 pb, ± 7 KDa Ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos Degradación mediada por ocupación bloqueo estérico ARN de interferencia pequeños Cadena doble: sentido y antisentido 19-22 pb, ± 14 KDa Ribonucleótidos Degradación mediada por ocupación 6 // EDITORIAL SCIENS
